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Nature Communications volume 14, número do artigo: 1455 (2023) Citar este artigo

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Identificar como as pequenas moléculas agem para matar os parasitas da malária pode levar a novos alvos “validados quimicamente”. Ao pressionar os parasitas assexuados do estágio sanguíneo do Plasmodium falciparum com três novos compostos antimaláricos estruturalmente não relacionados (MMV665924, MMV019719 e MMV897615) e realizar a análise da sequência do genoma completo em linhas de parasitas resistentes, identificamos múltiplas mutações na acil-CoA sintetase de P. falciparum ( ACS) genes PfACS10 (PF3D7_0525100, M300I, A268D/V, F427L) e PfACS11 (PF3D7_1238800, F387V, D648Y e E668K). A substituição alélica e o perfil do proteoma térmico validam o PfACS10 como um alvo desses compostos. Demonstramos que esta proteína é essencial para o crescimento do parasita por knockdown condicional e observamos aumento da suscetibilidade ao composto após redução da expressão. A inibição do PfACS10 leva a uma redução nos triacilgliceróis e ao acúmulo de seus precursores lipídicos, fornecendo informações importantes sobre sua função. A análise do gene PfACS11 e suas mutações apontam para um papel na mediação da resistência através da diminuição da estabilidade proteica.

Apesar dos progressos notáveis na eliminação da malária, o Relatório Mundial da Malária de 2022 estimou 247 milhões de novos casos e 619.000 mortes atribuíveis à malária em 20211. Um número limitado de classes de medicamentos antimaláricos é utilizado para tratar a doença e existe um grau de resistência a quase todos os agentes terapêuticos. ocorreu em pelo menos algumas populações do parasita Plasmodium falciparum em áreas endêmicas. A identificação de novos antimaláricos que visem novas vias é essencial para aumentar o repertório de medicamentos disponíveis.

Durante a última década, mais de 5 milhões de compostos foram testados contra P. falciparum em triagens fenotípicas e mais de 25.000 resultados com atividade baixa ou submicromolar foram identificados2,3,4,5,6,7. A identificação de alvos quimicamente validados destes compostos atingidos pode catalisar a utilização de abordagens poderosas, como a descoberta de medicamentos guiados pela estrutura, o rastreio de fragmentos ou bibliotecas codificadas por ADN para acelerar a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos contra a malária. O consórcio Malaria Drug Accelerator (MalDA) procura identificar novos alvos de medicamentos em P. falciparum através de uma abordagem quimiogenómica8, concentrando-se em pequenas moléculas identificadas como resultados no rastreio fenotípico de células inteiras. Uma estratégia importante deste consórcio é aplicar a evolução in vitro de parasitas resistentes e o sequenciamento de próxima geração de alto rendimento, que identificou vários novos alvos e mecanismos de resistência9,10,11,12.

Aqui aproveitamos relatórios anteriores de experimentos de evolução de resistência in vitro com três estruturas químicas distintas (MMV665924, MMV019719 e MMV897615) para obter novos insights sobre os alvos de drogas candidatas PfACS10 e PfACS11, membros conservados da acil-CoA sintetase de P. falciparum (PfACS) família de enzimas8,12,13. As enzimas PfACS são mais semelhantes às sintetases de ácidos graxos de cadeia longa (ACSLs), que ativam ácidos graxos livres (FA) de uma cadeia acila preferida de 12-20, acoplando-os à coenzima A em um processo dependente de ATP em duas etapas. , resultando em acil-CoA14. ACSLs eucarióticos mostram preferências por comprimentos específicos de substrato FA e graus de saturação . Os parasitas eliminam FAs do hospedeiro e a ativação de FAs por PfACSs permite que eles sejam incorporados em várias espécies lipídicas essenciais para o crescimento do parasita. Isso inclui acúmulo de lipídios neutros (triacilgliceróis e diacilgliceróis) em gotículas lipídicas21,22.

Utilizando substituição alélica e perfil de proteoma térmico, fornecemos aqui evidências de PfACS10 como sendo uma proteína essencial e alvo de MMV665924, MMV019719 e MMV897615. A inibição do PfACS10 leva à redução dos triacilgliceróis e ao acúmulo de seus precursores lipídicos. Por outro lado, enquanto a substituição alélica de mutações em PfACS11 fenocopia as linhagens selecionadas, nossos dados de knockdown condicional demonstram que PfACS11 não é essencial para o crescimento assexuado do parasita, implicando que PfACS11 pode estar mediando a resistência em vez de ser um alvo direto.

0.01 from globally diverse isolates (www.malariagen.net/pf3k). The length of the bars represents the local MAF of each variant in West (blue) or East (purple) Africa. The selected variants are indicated by red, blue, and yellow arrows. Dark green boxes indicate the ACS motifs: P: P-loop, G: Gate motif, A: Adenine binding site, L: Linker. c Representative dose-response assay for a clonal line of CF04.008 (ACS10 M300, gray) and two clonal lines of CF04.009 (ACS10 M300I, red) from Malawi. Assays were run in triplicate and repeated twice. Shown are the average ±SD and the non-linear regression curve fit for one biological assay run in triplicate. Source data are provided as a Source Data file. MAF minor allele frequency, π pairwise nucleotide diversity within each country, FST divergence./p>0.01 are depicted in orange (Fig. 3 and Supplementary 4). Resistance-associated mutations are depicted in red./p>43% coverage of the P. falciparum proteome. This compares favorably with the coverage reported for previous TPP and cellular thermal shift assays coupled with mass spectrometry (MS-CETSA) studies with P. falciparum37,38. TPP datasets were analyzed using the standard melting temperature (Tm)-based method, as described in an earlier TPP publication39. This analysis assesses individual protein melt curves using several criteria including curve R2, variability in Tm values within the control sample, maximum curve plateau, and minimum slope. Melting point differences (ΔTm = Tm, treated–Tm, control) are then established for every detectable protein. Only the most significantly affected proteins are selected as potential “hits” by applying an FDR-adjusted z-test to ΔTm data. Proteins with a p-value <0.1 in two separate technical replicates are considered “hits”. Hits found in two biological replicas are considered as putative targets./p>

1.5, mapping quality > 40, min base quality score > 18, read depth > 5) to obtain high quality SNPs that were annotated using SnpEff version 4.3t68. BIC-Seq version 1.1.269 was used to discover copy number variants (CNVs) against the parental strain using the Bayesian statistical model. SNPs and CNVs were visually inspected and confirmed using Integrative Genome Viewer (IGV). All gene annotations in the analysis were based on PlasmoDB-48_Pfalciparum3D7 (https://plasmodb.org/plasmo/app/downloads/release-48/Pfalciparum3D7/gff/)./p>25% of samples, or showed high levels of heterozygosity within single infections (>25%). Additionally, 558 genes failed gene-level quality filters (≥20% heterozygous calls or ≥20% missing calls across samples) and were removed from the analysis. Calculations of pairwise nucleotide diversity (π) and Weir and Cockerham’s FST estimator were performed the PfalGeneDiversityStats package71./p>0.8. The statistical significance was calculated using a z-test and only proteins with a p-value < 0.2 in both technical replicates were considered hits. Hits found in two biological replicates were considered putative targets. Alternatively, we used the NPARC method (non-parametric analysis of response curves), a strategy that compares the experimental data to two models: a null model that assumes that drug has no influence on the protein melting behavior, and an alternative model that assumes that drug affects the melting behavior. Any data-driven adjustments to these models were calculated and assessed for statistical significance using an F-test, generating a p-value. All TPP datasets generated with MMV897615 have been deposited to the ProteomeXchange Consortium via the PRIDE partner repository77 under the identifier PXD034937./p>